包涵体(生物大分子结构)

包涵体是生物大分子结构。在某些生长条件下,基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。

包涵体(生物大分子结构)

形成

在基因重组技术得到迅速发展之前,研究者就已经发现,细胞内人工引入反常的蛋白质(这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质),这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形,这些球形的物质全部是蛋白质,并且通过非共价键的作用力形成,必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后,人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。

Georgiou等人发现天然的蛋白质在大肠杆菌中大量表达时,如内酰氨酶和碱性磷酸酶的过量表达,都形成了包涵体,前者的包涵体在外周质,后者的包涵体存在于细胞质中。其它的宿主细胞中也发现了重组蛋白质过量表达时形成的包涵体或者聚集体,如细菌病毒、哺乳动物细胞中。

包涵体在一些外界压力下也可以形成,如温度,是影响包涵体形成与否的主要因素。有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体,这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。

最近认为较高的温度可能增加了蛋白质合成的速度、折叠中间体形成聚集体的速度以及疏水相互作用力,表达的蛋白质易于以包涵体的形式存在。

其它的发酵条件同样影响蛋白质包涵体的形成,发酵液中加入蔗糖可以大大降低内酰胺酶包涵体的形成。蔗糖的作用可能是稳定天然蛋白质的结构或者防止蛋白质折叠中间体的聚集。在体外的内酰胺酶折叠复性的过程中,同样发现复性缓冲液中加入蔗糖可以提高蛋白质的复性率。其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇(诱导热休克蛋白质的表达)、低分子量的巯基或二硫化合物(影响细胞周质的还原态,从而影响二硫键的形成)和NaCl。也有报道认为在丰富的培养基中有利于活性蛋白质的表达,当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体。

蛋白质的聚集体和包涵体不仅仅存在于重组蛋白质的表达中,是一个广泛存在的现象。通常认为,蛋白质的聚集现象,无论细胞内还是细胞外,都是中间体不能完成折叠而形成自我聚集现象。包涵体的形成与多肽链的序列、表达速度、可用的伴侣分子的量以及生长的环境有关。

特点

包涵体是新合成的肽链在折叠过程中部分折叠的中间体形成的,而不是由完全的解折叠形式的蛋白质形成的,这可能与体外复性时聚集体的形成有相似的机制,

应该考虑到在包涵体中含有这些部分折叠的结构。但是,由于包涵体的特性,很难利用物理的方法去探测包涵体中蛋白质肽链的结构。

在大肠杆菌中,包涵体可以在细胞的两个位置出现:细胞质和外周胞质。包涵体在细胞内形成的位置和特点取决于蛋白质表达的方式。三种表达的内酰氨酶,一种是天然的内酰氨酶,一种是含有OmpA信号肽,一种完全切除了天然蛋白质的信号肤,当大量表达时,造成了聚集体的形成,前两者的聚集体在外周胞质,后者在细胞质内形成聚集。这些包涵体在大小和形状有相当清楚的差别,这些差别表现了聚集体的表面形态、组成和形成聚集体的多肽链构象上的不同。

大肠杆菌细胞质中的包涵体直径一般在0.2到1.5μm之间,不同的蛋白质具有不同的直径,如干扰素的大小是0.811μm,而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下,有些包涵体比较大,直径大于大肠杆菌的直径,使得大肠杆菌有一个突起。一般情况下,一个细胞仅有一个包涵体。包涵体从来不吸附在膜上,并且不同于真核细胞中的其它的细胞器。高精度的投射电子显微镜显示了多孔的结构。

所有的包涵体密度较大,是微生物细胞中密度最大的结构,密度在1.1-1.3之间,不同蛋白质的包涵体的密度也不同,一些低分子量的包涵体结构是多孔的。

包涵体有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体),有的位于细胞核中(如疱疹病毒),或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。

有的包涵体还具有特殊名称,如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体,狂犬病毒包涵体叫内基氏(Vegri)小体。昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。

分离

一旦一个稳定的、重复的发酵过程建立起来,则要考虑提取包涵体的步骤了。包涵体处在细胞质内或者细胞的外周质,必须破坏细胞膜才能把包涵体释放出来。

溶液中的包涵体也要同破碎液中溶解的成分和不溶的其它成分如细胞碎片、细胞膜以及核糖体等成分分离开来。

提取的第一步是冷却发酵液,利用离心或者错流过滤的方法收集细胞,细胞的沉淀利用设定的含有一定浓度的离子强度(0.4-0.6mo1)的缓冲液悬浮。这种缓冲液必须控制pH、离子强度、重金属的浓度和氧化还原的环境,在以后的操作步骤中也要考虑这些因素。

而包涵体蛋白质的密度比相同体积的细胞碎片的密度大得多,所以使用离心的手段可以把包涵体与细胞的其它成分分离开来。如果细胞碎片没有同包涵体分离,在以后的分离手段中必须把膜上的组分分离开来。有时,有些目标蛋白质以溶解的形式存在,可以通过在细胞破碎以前加入一些非极性的物质(如苯酚、甲苯)或者去垢剂,通过这个方法可以提高从大肠杆菌表达的人生长激素包涵体的收率。

连续离心技术是工业生产中获得包涵体最经常使用的操作。由于细胞碎片的密度比包涵体小,则沉降的速度比包涵体要小,连续的悬浮、离心可以把大部分的包涵体离心下来,而细胞碎片逐步除去。SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳)分析发现,离心的方法可以达到沉降物中的蛋白质的含量大于90%。

当细胞碎片与包涵体混在一起难于分离时,可以采用一些化学的方法把细胞碎片离子交换色谱复性蛋白质与包涵体分离开,否则溶解包涵体以后,膜蛋白质溶在包涵体蛋白质的溶液中,会污染以后的操作。特别如果一些膜蛋白质具有蛋白质酶的活性,则溶解以后的包涵体蛋白质可被降解。如果溶解原核细胞膜蛋白质的一些溶剂不能溶解包涵体蛋白质时,可以使用溶解的方法把膜蛋白质除去。最经常的选择性溶解膜蛋白质的方法是利用鳌合金属的试剂如EDTA、中性的去垢剂如Triton X-100,或者一些盐如,脱氧胆酸盐,或者弱离液剂,如2mol/L的脲。Babbit等人发现经过前面的步骤,可以提高肌氨酸激酶的复性收率,活性提高的原因是使用弱的去垢剂辛基糖除去了蛋白质酶。

离心和高压匀浆都有可能产生泡沫,所以必须在工业规模中避免这种无谓的损失。有些工业生产中,分离以前在发酵罐中把细胞杀死使细胞内的物质释放出来,并同时溶解或者不溶解包涵体蛋白质。这种在线杀死细胞的方法己经用来生产两种蛋白质:在碱性条件下溶解类胰岛素生长因子和高温、酸性条件下生产重组的抗真菌肽段。这种方法的优点是可以节省操作时间以及能量消耗,仅仅需要一步离心的步骤。最经常使用的杀死细胞的试剂有苯乙醇,辛酸,氯仿,甲苯等。杀死细胞时也有缺点,溶解的目标蛋白质中含有蛋白质或者非蛋白质的物质,降低了蛋白质的纯度;如果目标蛋白质没有被溶解,则杀死细胞会使可溶蛋白质产生沉淀,使得包涵体的纯化比较困难,或者破坏包涵体内部的重组蛋白质。

溶解

维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力,这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的,但是,现在趋向于一致,就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键,无论是正确的还是错误的二硫键,在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质,溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分,当蛋白质被溶解以后,则进入到蛋白质的体外折叠的过程。

1. 遵循标准

包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本,必须遵循以下的标准:

(1) 快速溶解的动力学;

(2) 与蛋白质的结合是可逆的;

(3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用;

(4) 对温度没有依赖作用;

(5) 抑制蛋白质酶的降解作用;

(6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用;

(7) 在可能的情况下,选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂,并适于以后的复性方法。

2. 溶解包涵体的试剂

最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。

最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂,但是一般不用来大规模的生产,而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外,其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解,蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键,然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化,可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。

(3)混合溶剂

一般情况下去垢剂并不联合使用,Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢剂型的盐混合可以使蛋白质变性,但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性,所以要避免使用。

去垢剂结合其他的试剂或者溶解增强剂也被使用,发现尿素和乙酸,尿素和二甲亚枫,尿素和高pH等是比较有效的溶解包涵体蛋白质的方法。

高压(1-2kbar)、超声也可以溶解包涵体蛋白质,此时使用的溶解试剂浓度可以比较低,便于后续的复性步骤。

3. 极端pH

酸碱度也是比较廉价的有效的溶解包涵体的方法。最经常使用酸的是有机酸,浓度在5-80%之间。Gavif和Better使用低的(pH≤2.6)和高温(85℃ )溶解抗真菌的重组蛋白质的肤段,低温和高PH需要溶解时间要长。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一种麦芽糖结合的蛋白质。但是,同样的一些不可逆的修饰作用或者酸降解会在极端pH下发生,所以此种方法并不是经常使用的溶解包涵体的方法。

高pH(≥12)也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性,原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价,同样仅仅用于一些特定的蛋白质,特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。

包涵体与蛋白质

1. 真核细胞表达外源蛋白质的缺点

一些蛋白质需要翻译后的修饰,如糖基化,则必须选用真核细胞。但是无论是正在临床的还是市场上的蛋白质药物,主要的是以大肠杆菌作为宿主细胞。

1982年第一次选用大肠杆菌作为表达重组DNA的宿主细胞,表达的产物是人胰岛素。选择原核细胞作为表达载体,因为真核细胞表达外源蛋白质有其缺点:

(1)真核细胞的天然蛋白质的表达和外源蛋白质的表达,表达量相当少,即使有的蛋白质表达量高时,容易出现蛋白质的无活性的现象,或者形成聚集体;而原核细胞表达的蛋白质量比真核细胞大很多;

(2)相对于大肠杆菌,人类对于真核细胞的基因的了解还是有限的,而对大肠杆菌的基因了解的相当透彻,并能进行熟练的基因重组等操作对大肠杆菌的基因进行改造;

(3)真核细胞生长到高密度需要更长的时间(7天左右),并且细胞的最终浓度低,所以需要较大的培养容器,而大肠杆菌可以在几个h以内达到108cells/mL;

(4)动物细胞生长的培养液的造价较高,并且大部分使用血清作为生长液的添加剂,从而提高了产品的造价并且不利于以后的纯化步骤;

(5)原核细胞的坚硬的细胞壁,可以使用简单的搅拌的方法完成传热、传质过程,而大部分的真核细胞需要温和的培养方法及复杂的操作以达到其对培养基的要求 。

基于以上的原因,真核细胞尤其是哺乳动物细胞表达外源蛋白质大部分处在研究阶段,大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞。大肠杆菌表达的外源蛋白质量相当大,有时达到细胞内蛋白质总量的5-20%,甚至达到50%以上。但是,大肠杆菌表达的蛋白质,当含量相当大时,有时由于原核细胞缺少分泌到胞外的机制或者折叠的机制,最后表达的蛋白质往往以无活性的包涵体的形式存在。

2. 包涵体表达蛋白质的优越性

为了研究基因的功能,可以把体内的基因转移到其他表达宿主中,研究基因表达性状以确定基因的功能。但是,外源基因的表达,特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达,由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制,细胞内的化学环境与其天然环境差异,如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度,以及外源基因的导入,使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长,表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。

在下游生产过程中特别是在医药生产中,以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。

(1) 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解,如果重组蛋白质以包涵体形式表达,由于包埋了酶攻击的位点,可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击;

(2) 包涵体表达的蛋白质没有活性,细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题;

(3) 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便,造价低,使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离;

(4) 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死,大量表达时会导致细胞的死亡,最终的细胞数量和产物相当低;而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达;

(5) 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性,含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率,不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。

该文章由作者:【圣甲虫】发布,本站仅提供存储、如有版权、错误、违法等相关信息请联系,本站会在1个工作日内进行整改,谢谢!

发表回复

登录后才能评论